保元汤中总多糖、总黄酮、总皂苷三大类成分的含量测定
引言
《简明医彀》中的保元汤由五味药组成：人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜5味药组成。“人参一钱，黄芪二钱，甘草五分，肉桂二分，右加生姜一片，水煎服”，其主治“元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青白...及有杂证”。该方沿用至今，历史悠久，传统治疗虚损劳怯、元气不足[4]。现代研究明确保元汤具有保护肝腑脏器、调节免疫功能、抗疲劳、抗氧化、抑制肿瘤细胞转移等作用，临床应用于慢性心力衰竭以及气血不足等慢性虚弱症的治疗。本课题的研究以功效为导向选择指标成分，建立保元汤物质基准中大类成分(总多糖、总黄酮、总皂苷)含量测定分析方法，为保元汤物质基准的质量研究提供分析方法基础。
1材料
1.1药材
1.2仪器
分析天平
1.3试剂
2方法
2.1保元汤制备
制备流程为：人参7.5g、黄芪14.9g、甘草3.72g、肉桂1.5g、生姜2g，以10倍水浸泡30min，武火至沸腾，文火煎煮40min，煎液以双层纱布趁热过滤。60℃水浴，减压浓缩至150mL即得。
2.2冻干粉制备
经课题组前期研究，将标准煎液在-80℃预冻5h，冷冻干燥72h即得冻干粉。
2.3总多糖含量测定方法的建立
2.3.1供试品溶液制备
精密量取标准汤剂15mL(或冻干粉500mg，以15mL纯化水溶解)，加入乙醇离心吹干后以5.0mL水溶解，冻干后得粗多糖。精密称取粗多糖5.0mg，以纯化水溶解定容至25mL，即得。
2.3.2试剂用量考察
2.3.2.1醇沉倍数
称取冻干粉500mg，以15mL水溶解，考察2、4、6、8、10、12倍的醇沉条件对多糖含量影响。
2.3.2.2苯酚浓度
苯酚硫酸法检测得不同苯酚浓度反应下的样品波长扫描图。
2.3.2.3硫酸用量
在确定苯酚的浓度的情况下，改变浓硫酸用量(0mL、3mL、5mL、7mL、9mL)，检测得扫描图。
2.3.3方法学验证
2.3.3.1线性与范围
精密吸取对照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，苯酚硫酸法分别重复测定3次吸光度，绘制标准曲线。
2.3.3.2精密度试验
制备供试品溶液，在最大吸收波长处读取吸光度，重复6次，计算RSD值。
2.3.3.3重复性试验
平行制备6份供试品溶液，在最大吸收波长处读取吸光度，每份重复测定3次，计算RSD值。
2.3.3.4稳定性试验
制备供试品溶液，在24h内按1、2、4、6、8、10、20、24h在最大波长处测定吸光度，重复3次测定，并计算其RSD值。
2.3.3.5加样回收率试验
向已知被测成分含量的供试品，按1∶1的比例加入D无水葡萄糖，平行制备6份，按照以下公式计算加样回收率。
2.3.3.6验证试验
照2.3.1制备供试品溶液，反应时精密移取供试品溶液1.0mL，照本节“2.3.3.1”的线性与范围项下方法，计算D-葡萄糖的量。
2.4总黄酮含量测定方法的建立
2.4.1对照品的选择
制备每1mL含0.8mg的三种对照品溶液与铝盐反应后，选择最佳的总黄酮含量的对照品。
2.4.2样品前处理考察
精密量取标准汤剂15mL，考察过固相萃取柱、标准煎液直接稀释在进行亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法后，进行全波长扫描。
2.4.3方法学验证
2.4.3.1线性与范围
精密吸取对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，补至0.5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，加10%硝酸铝溶液1mL，加4%氢氧化钠试液10mL，重复测定3次吸光度。
2.4.3.2精密度试验
按照以上确定的条件方法制备供试品溶液，测定吸光度，重复6次，计算RSD值。
2.4.3.3重复性试验
平行制备6份供试品溶液，测定吸光度，重复3次，计算RSD值。
2.4.3.4稳定性试验
制备供试品溶液，在24h内按0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h的时间点，测定吸光度，重复3次，计算RSD值。
2.4.3.5加样回收率试验
取已知浓度样品，按质量1：1的比例分别加入甘草苷对照品适量，按以上条件进行反应，平行制备6份，按照2.3.3.5公式计算加样回收率。
2.4.3.6验证试验
照2.3.1制备粗多糖，过固相萃取柱，以10.0mL的水和甲醇洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至100mL，得供试品溶液，反应时取0.5mL，照本节绘制标准曲线方法，计算甘草苷的量。
2.5总皂苷含量测定方法的建立
2.5.1样品前处理考察
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re对照品5mg，以甲醇溶解并定容至50mL。
供试品溶液的制备：照2.3.1制备供试品溶液，考察以10倍乙醇醇沉后取上清液和过固相萃取柱的两种前处理方法。
2.5.2试剂用量条件考察
硫酸乙醇溶液：取人参皂苷Re200μL，挥去溶剂，加入0.5mL的8%香草醛乙醇试液，分别加入72%、75%、77%的硫酸乙醇溶液5.0mL。
香草醛乙醇溶液：考察6%、8%、10%、12%的香草醛乙醇对试验结果的影响。
2.5.3方法学验证
2.5.3.1线性与范围
精密吸取人参皂苷Re对照品溶液0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，加入8%香草醛乙醇0.5mL和77%硫酸乙醇5mL，60℃反应15min后，冰水浴2min，测定吸光度，重复3次。
2.5.3.2精密度试验
制备供试品溶液测定吸光度，重复6次，并计算RSD值。
2.5.3.3重复性试验
同批次样品平行制备6份供试品溶液，测定吸光度，重复3次，并计算RSD值。
2.5.3.4稳定性试验
在10h内按0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h的时间点，读取吸光度，重复3次，计算吸光度RSD值。
2.5.3.5加样回收率试验
取已知浓度的供试品，按1∶1的比例加入人参皂苷Re，平行制备6份，按照2.3.3.5公式分别计算加样回收率。
2.5.3.6验证试验
照2.3.1制备供试品溶液，平行制备3份。精密吸取200μL，按照本节中绘制标准曲线的方法，测定吸光度，测定3次计算人参皂苷Re的量。
讨论
天然植物类药物中多存在多糖类物质，其特性可用于计算总多糖的含量。人参中多含有不易溶性的多糖成分，采用醇沉挥干有机试剂后立即以纯化水复溶，以冻干形成冻干粉的均匀状态进行总多糖的测定，以实现测定方法的准确性。
黄酮类化合物存在于大多植物中，检测黄酮类的文献中多以芦丁为对照品，但由于保元汤中的黄酮类与芦丁在化学结构上的形成共轭结构，导致在相同的反应中呈现不同的颜色以及最大吸收波长，故依据黄酮类物质的结构性质，选择最佳的对照品以及前处理方法以满足总黄酮含量测定的准确性。
皂苷类物质广泛分布于植物界中，保元汤中的皂苷类物质来源于人参、黄芪和甘草。无水条件下，三萜皂苷类物质在强酸环境中发生反应形成发色基团后显色，由此可根据最大吸收波长进行定量测定。
文章来源：[1]张壮,王志强,邹妍,等.保元汤中总多糖、总黄酮、总皂苷三大类成分的含量测定[J].广东化工,2025,52(02):132-137.
