紫外可见光度计

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紫外可见分光光度计检测食品中的酶活性

发布日期:2018-07-20  点击次数:

关键词:紫外可见分光光度计;UV-1800SPC;美析仪器www.macylab.com;

  

酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑,我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强,在食品加工过程中添加酶制剂,使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免,可以通过加热等方法将酶灭活,消除其不利影响。

  为了将酶更好地应用于食品加工,研究酶的性质是十分必要的。而紫外可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用紫外可见分光光度计测定酶活的具体方法。

  紫外可见分光光度法测定酶活性:

  1. β半乳糖苷酶

  一β一半乳糖苷酶,又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量,从而提高乳制品的可消化性,用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变,同时还可用于生产低聚半乳糖。

  【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

  【酶活定义】以ONPG为底物,37℃保温酶解,每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量,定义为1个酶活力单位。

  2. 超氧化物歧化酶

  超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类,是生物体内超氧阴离子清除剂,保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内,所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969Mccord等人首次发现了SOD生物活性后,医学界对其医疗作用做了许多研究,证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用,被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。

  【酶活测定】在254.5ml 50mmol/L pH8.3K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液,再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚,迅速摇匀,倒人光径lcm 的比色杯,在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品,对所测样品SOD活性进行校正。

  【酶活定义】在lml反应液中,每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位, 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。

  3. 多酚氧化酶

  多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶,其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后,具有单宁性质,易和蛋白质起交联作用而沉淀出来,进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO以“潜伏”状态存在,在浸麦过程中,可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中,PPO的活力较高,影响着麦芽的质量。因此,在制麦过程中应该降低PPO活性。

  【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min,用2mL 20%TCA终止反应,于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。

  【酶活定义】上述条件下,将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。

  4.葡萄糖氧化酶

  上世纪60年代以前,葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业,除去葡萄糖,防止发生Maillard反应,稳定产品质量,延长保质期。80年代末,又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途,并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。

  【酶活测定】采用-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2,在过氧化物酶(POD)作用下,氧供体即邻一联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化,即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。

  【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。

  5. 果胶酶

  果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香,并提高葡萄酒出汁率等,对提高红葡萄酒的品质有重要作用。

  【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制,调节pH 10.0),于55℃水浴下保温5 min,然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min,加入DNS试剂1.5 mL,混匀,在沸水中加热10min,立即用自来水冷却,再加入21.5 mL蒸馏水,混匀,于分光光度计上520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。

  【酶活定义】在上述试验条件下,以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。

  6. 胰α-淀粉酶

  【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管,并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min,冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。

  7. 植酸酶

  【酶活测定】 以植酸钠为底物,采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠(酶作用底物,用0.25 mol/lpH5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml37 oC预热5 min后,准确加入适当稀释的酶液0.5 ml(对照组先加反应终止液),37 oC水浴反应30min后,再加入4 ml反应终止液(现用现配)冷却至室温,在415 nm处测定OD值,利用无机磷标准曲线计算出酶活。

  【酶活定义】在37℃,每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中(用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。

  8. 羧甲基纤维素酶

  【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液,于50℃水浴中保温30min,加2.0 mL质量分数为10%NaOH溶液终止反应,再加入2.5mLDNS试剂,于沸水浴中煮沸15min,冷却,在550 nm波长处比色,要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照,对照管先加入0.5mL酶液,然后加入2. 0 mL质量分数为10%NaOH溶液将酶灭活,再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL,与待测管一起保温,加入DNS,煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。

  【酶活定义】在上述条件下,每30min产生0.5mg还原糖为1Cx活力单位,即每1 h产生1.0mg还原糖为1Cx活力单位。

  9. 木聚糖酶

  木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖),使其成为水溶性的,水解率达65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖,能提高面团的持水性和机械强度,使面团具有更好的持气能力和操作耐力,进而提高馒头和面包的品质。

  【酶活测定】以木聚糖为底物,用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml,加1%木聚糖液0.9ml,置50℃水浴保温30min后,加DNS 2ml于沸水浴中显色3min,用自来水冷却后,加蒸馏水定容25ml,测O.D值。

  【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。

  10. 蛋白酶

  【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度,可得到酶解产生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的总酶活力。

【酶活测定】取3支试管(一支空白管,两支样品管),分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL,将3支试管放入40℃水浴中预热5 min,同时将测定底物(1%酪素)置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时,反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管,分别吸取上述相应滤出液1.0 mL0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀,置40℃水浴中放置20 min(显色),取出,迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点,在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。

 

关键词:紫外可见分光光度计;UV-1800SPC;美析仪器www.macylab.com;